-
מיקרוסקופ קונפוקלי מתייחס לסוג של מיקרוסקופ אופטי מיוחד שיכול לרשום פרוסות אופטיות.
על ידי הארה והתבוננות בנקודת מגבלת דיפרקציה יחידה, פרוס אופטי מתממש במערכת קונפוקלית בלייזר. זה דורש שלשני קטעי הקורה יהיה אותו מיקוד, ולכן הם "קונפוקלים". בניגוד לתמונות בשטח רחב, לתמונות קונפוקליות אין טשטוש מבוטל. זהו יתרון בפני עצמו, מכיוון שהתמונה העמוקה של המדגם ברורה ועשירה בפרטים. עם זאת, היתרון החשוב ביותר הוא פוטנציאל ההדמיה התלת ממדי שלו עם תכונות מיקרוסקופיות. לאחר רכישת רצף התמונות לאורך העמידה Z, האובייקט התלת-ממדי משוחזר ומוצג על ידי המחשב.
- תאורה קונפוקלית
תאורת מקור אור נקודה מתממשת על ידי מיקוד מקור האור בצמצם קטן (חור חור) ואז מיקודו במדגם. כאשר הצמצם קטן מספיק, נקודת ההארה מוגבלת רק על ידי דיפרקציה, ולא על ידי הפרמטרים הגיאומטריים של מקור האור והצמצם. מקור אור רגיל הוא מקור תאורת פנים גדול, ולכן אי אפשר למקד אותו במקום מגבלת ההפרדה. לכן, למרות שהעברה נמוכה מאוד, סוג זה של תאורה ממוקדת עדיין נחוץ מאוד (למקורות אור מסורתיים).
איור 1: תאורה להדמיה קונפוקלית. האור ממקור האור (LS) ממוקד בפינה האיר (PI) ואז נכנס לדגימה S ..
בלייזר כמקור אור יש התנגשות גבוהה מאוד (האור בלייזר טוב הוא "מקביל ביותר"). לכן, ניתן להתמקד בלייזר במקום מוגבל דיפרקציה דרך עדשה יחידה מבלי להשתמש בחור חור. לפיכך, לרוב המיקרוסקופים הקונפוקליים אין חור תריס. איכות נקודת האור תלויה באיכות הקורה של הלייזר. אם האיכות אינה טובה, אתה יכול גם להכניס את חור התאורה. הלייזר משולב בדרך כלל למיקרוסקופ הקונפוקלי באמצעות סיבים אופטיים. סיבים אלה עצמם פועלים גם כחורים.
המוקדיזציה וצפיפות האנרגיה הגבוהה של לייזר הופכים אותו למקור אור אידיאלי למיקרוסקופ קונפוקלי. קוהרנטיות של לייזר אינה תכונה נדרשת של ביצועים קונפוקליים. נהפוך הוא, זהו אתגר עבור מעצבים אופטיים, מכיוון שהוא יגרום לדפוסי הפרעה כוזבים, ולכן יש צורך באסטרטגיות עיצוב זהירות.
בנוסף, העובדה שהלייזר המסורתי פולט רק צבע יחיד (לייזר-"קו") יש מגבלות משלו. בהדמיה ובמדידה רב פלואורסצנטי, יש צורך בסידור רב-לייזר מורכב. לייזר לבן פותר במיומנות את בעיית ההדמיה הרב-צבעונית.
איור 2: השוואה בין קונפוקלים (שטח ימין) והדמיה לא קונפוקלית. בטרופובלסט עכברים מוכתמים של Feulgen. מידע רב על תמונות שאינן קונפוקליות אינו מגיע ממטוס מוקד. אופטיקה קונפוקלית מבטלת את כל הגורמים המטושטשים ומבהירה את המבנה.
גילוי קונפוקלי
לרוב הגלאים יש שטח רגיש די גדול (צינורות פוטו -מכפילים הם בדרך כלל מספר סנטימטרים רבועים). אופטיקה קונפוקלית זקוקה לחישת נקודה. לכן יש צורך לבצע איתור נקודה על ידי הכנסת צמצם קטן (חור חור) לקרן האור. מיקוד האור של הדגימה על חור החור, אוסף ומקליט את האור המועבר.
מכיוון שתבנית ההפרדה תלויה בצמצם המספרי ובאורך הגל, יש צורך בזיהוי חור חור. לכן, כאשר פרמטרים אלה משתנים, יש להתאים את גודל חור החור.
כאשר העדשה האובייקטיבית משתנה (בדרך כלל עם שינוי הצמצם המספרי), מיקרוסקופ סריקה קונפוקלי מודרני ישנה אוטומטית את קוטר חור הסיכה באופן מתאים. לפיכך, חורי סיכה מעוצבים בדרך כלל כצמצמים כפולים או רב שכבתיים.
למעשה, הגודל המתאים של חור חור תלוי לא רק באורך הגל ובצמצם המספרי, אלא גם בהגדלה הפנימית של אלמנטים אופטיים במיקרוסקופ.
לכן, זה לא רק לא רצוי אלא גם לא נכון להשוות ישירות לקטרים של חור חור במיקרוסקופים עם עיצובים שונים. אם קוטר החור אינו מוגדר לערך האופטימלי, המערכת לא תוכל לבצע פרוסות אופטיות בצורה חלקה (כלומר, להעביר טשטוש dempocus), או לנתק את העוצמה שלא לצורך מבלי לקבל איכות פרוסה אופטית נוספת (וכתוצאה מכך תמונות רעש מיותרות).
איור 3: איתור בהדמיה קונפוקלית. האור מהמדגם S מתמקד בתצפית חור התצפית (PO) ואז על הגלאי DE.
מסלול אופטי של סריקה קונפוקלית
נתיב הקורה הקונפוקלי במערכת סריקה קונפוקלית הוא רק השילוב של תאורת מקור נקודה וגילוי נקודות. שילוב זה יכול לשמש כסכין אופטית. ניתן להעביר רק פוטונים ממישור המוקד לחיישן. בעוד שכל הפוטונים ממקומות אחרים מסוננים. פרוסות אופטיות מתממשות באמצעות "פילטר מרחבי".
מכיוון שרק נקודה אחת מופיעה הדמיה "קונפוקלית" בזמן נתון, יש צורך במכשיר סריקה כדי להזיז את המקום בשדה האובייקט במצב רשת. בדרך כלל המראה האופטית מותקנת על מנוע הסריקה ומשמשת לביצוע נוהל הסריקה. יש צוואר בקבוק בזמן הנדרש לסרוק מסגרת מלאה (בדרך כלל) 1,024 קווים. שיפורים הושגו על ידי הצגת סורק במהירות גבוהה (סורק תהודה) הסורק 8, 000 או יותר קווים בשנייה.
רק בטכנולוגיית המיקרוסקופ של אור משתקף ניתן להשיג פרוסה אופטית טובה. זו אחת הסיבות להתפתחות נמרצת של מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות בעשרים השנים האחרונות (סיבות אחרות כוללות את המצאת החיסון, הכלאה DNA, ביוסנסור פלואורסצנטי, נקודות קוונטיות וחלבון פלורסנט).
איור 4: משמאל לימין: 1. חרוט ההארה לא רק מרגש את הצבע הפלואורסצנטי במישור המוקד, אלא גם מרגש אותו למעלה ולמטה. כאן מיוצג על ידי חרוט כפול ירוק. 2. חור הפליטה מיירט ביעילות את האור הנפלט מעל מישור המוקד. 3. בנוסף, האור מתחת למישור המוקד לא יעבור דרך חור הסינה. 4. במערכת הקונפוקלית, רק האור מהמדגם יגיע לגלאי. איתור חורים ידחו למעשה כל אור מאזורים אחרים. לבסוף מתקבל החלק האופטי האמיתי.
